目的 检测EMMPRIN、P-gp和VEGF在胰腺癌中的表达并进行临床相关性分析，以探讨胰腺癌细胞的多药耐药和浸润转移是否有关联。方法 应用免疫组化SP法检测34例胰腺癌组织中EMMPRIN、P-gp和VEGF的表达。结果 P-gp、EMMPRIN、VEGF在胰腺癌组织中的表达分别为55.9%、61.8%、64.7%。P-gp、EMMPRIN、VEGF的阳性表达与性别、年龄、肿瘤的大小及病理分化程度无关（P>0.05）。但与淋巴结转移有关（P<0.05）。EMMPRIN与 P-gp、VEGF存在相关性（P<0.05）。结论 P-gp 、EMMPRIN，VEGF在胰腺癌中均高表达，EMMPRIN与 P-gp、VEGF均有相关性，提示肿瘤的耐药、浸润和转移之间有一定的相关性。EMMPRIN作为一个新的靶点可能有良好的应用前景。在胰腺癌的化疗中要规范治疗，在减少耐药的同时可能也减少了肿瘤浸润转移的危险性。
关键词：EMMPRIN P-gp VEGF 胰腺癌 免疫组织化学
Expression of P-gp, EMMPRIN and VEGF in pancreatic cancer and their clinical correlation
WANG Yu, GUO Shuangshuang, YANG Qiong, XIE Derong
Department of Oncology, The Second Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510120,P.R.China
[Abstract] Objective Detected the expression of P-gp, EMMPRIN and VEGF in pancreatic cancer to study the correlation about invasion, metastasis and drug resistance. Method Detected the expression of P-gp, EMMPRIN and VEGF in 34 cases of pancreatic cancer by immunohistochemical method. Results The positive rates of P-gp, EMMPRIN and VEGF in pancreatic cancer were 55.9% ,61.8%, 64.7% respectively. P-gp, EMMPRIN and VEGF were associated with lymph node metastasis group(p<0.05). There are close relationship between EMMPRIN and P-gp, VEGF respectively(p<0.05). Conclusions P-gp, EMMPRIN and VEGF were higher expressed in pancreatic cancer. EMMPRIN with P-gp and EMMPRIN with VEGF have been correlated. It has indicated that during the progression of pancreatic cancer there are close relationship between invasion, metastasis and drug resistance. There is a good future for EMMPRIN as a new target drug. We should comply with regulation of chemotherapy in pancreatic cancer. which can decrease drug resistance and perhaps can decrease invasion, metastasis of tumor cell at the same time.
[keywords] EMMPRIN; P-gp; VEGF; pancreatic cancer immunohistochemistry
作者单位：510120 广州市中山大学附属第二医院
通讯作者：谢德荣xiederong@21cn.com
胰腺癌是发展迅速，预后不良的恶性肿瘤。其手术切除率低，术后易复发，因此化疗是主要的治疗手段[1]。但目前胰腺癌化疗效果欠佳，其主要原因是化疗多药耐药和肿瘤的浸润转移。目前有关这两方面分别有较深入的研究：耐药研究的较多的是MDR1基因的产物P-gp，而基质金属蛋白酶诱导剂EMMPRIN和血管内皮生长因子VEGF被认为与肿瘤的浸润和转移有关。然而耐药和浸润转移之间是互为独立还是相互关联？目前这方面的研究较少。本文用免疫组化的方法检测这三种物资在胰腺癌组织中的表达和临床意义以及它们的相互关系。以探讨胰腺癌发展过程中的耐药、浸润和转移是否有关联。
1 材料与方法
1.1 标本及临床病理资料 收集1995年6月~2005年5月中山大学附属第二医院胰腺癌组织手术切除标本34例，男性19例，女性15例，年龄38~73岁，平均年龄61.32+8.47岁，患者术前均未进行任何抗癌治疗，所有标本经HE染色证实为胰腺癌且均来源于胰腺导管上皮。病理类型包括中高分化腺癌22例，低分化12例。无淋巴结转移的14例，有淋巴结转移的20例。肿瘤直径大于3cm的23例，小于等于3cm 11例。所有标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片4µm。
1. 2主要试剂 兔抗人EMMPRIN多克隆抗体购自武汉博士德公司，抗体滴为1:100；鼠
抗人P-gp、VEGF单克隆抗体购自美国Neomarkers公司；抗体滴度为分别为1:25、1:50；SP试剂盒分别购自武汉博士德公司和福建迈新公司。
1.3 方法 标本常规用10%甲醛固定、石蜡包埋，制成4µm连续切片后，进行免疫组化SP法染色，主要步骤如下：切片脱蜡至水，微波修复15分钟（EMMPRIN、P-gp的修复液用PH6.0的柠檬酸盐，VEGF的修复液用PH8.0的EDTA），阻断内源性过氧化物酶10分钟，PBS冲洗3次；正常非免疫血清封闭30min，滴加I抗在室温孵育3h，PBS冲洗3次；滴加生物素化的II抗孵育30min，PBS冲洗3次；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物的III抗孵育30min，PBS冲洗3次；新鲜DAB-H2O2溶液显色，苏木素复染。以已知的阳性片做阳性对照，阴性对照以PBS代替I抗进行同步染色。阳性片购自福建迈新生物技术有限公司。
1.4 结果判定 细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞， P-gp、EMMPRIN在胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织中的阳性定位主要位于细胞膜和细胞浆；VEGF的阳性定位主要位于细胞浆。阳性细胞占肿瘤细胞10%及以上为阳性，否则为阴性。
1.5 统计方法 采用SPSS10.0的分析软件，用χ2分析。
2 结果
2.1 P-gp、EMMPRIN和VEGF在胰腺癌组织中均为高表达（见附图），阳性表达率分别为55.9%（19/34）、61.8%(21/34)、64.7% (22/34)。P-gp、EMMPRIN和VEGF的阳性表达与性别、年龄、肿瘤的大小、及病理分化程度无关（P>0.05），与淋巴结转移有关，淋巴结转移阳性的P-gp、EMMPRIN和VEGF阳性表达率分别70%、80%、80%，与无淋巴结转移的差异有显著性，P值分别为0.013、0.014、0.036
2.2 P-gp， EMMPRIN，VEGF在胰腺癌表达相互之间的关系 如表2、3所示 ，EMMPRIN与P-gp在癌组织中同时阳性的率为44.1%， EMMPRIN与VEGF在癌组织中同时阳性的率为44.1%， VEGF与 P-gp在癌组织中同时阳性的率50%。EMMPRIN与P-gp，EMMPRIN与VEGF有相关性，P值分别为0.034、0.033。P-gp与VEGF之间未见相关（P=0.075）
3 讨论
肿瘤的多药耐药和浸润转移是治疗失败的主要原因，在胰腺癌的研究中，对于肿瘤细胞的耐药、浸润和转移分别都有较广泛深入的研究。多药耐药的原因有很多，研究最早，最广泛的是MDR1的基因产物P-gp，P-gp耐药作用的确切机制一直存在争议,现在比较普遍的一种学说认为, P-gp属于ABC转运蛋白家族,具有特异的药物结合位点和ATP结合位点,且本身具有ATP酶活性。能够利用ATP水解释放的能量,将大量结构不相关的药物跨膜转移到胞外,使细胞内药物浓度减少,从而产生抗药性[2-3]。本文通过免疫组化的方法检测出P-gp在胰腺癌组织中高表达，且其表达与临床分期有关。目前国内外相关研究也指出P-gp在胰腺癌组织中是高表达的，但其与临床参数之间的意义却结论不一[4-5]。国内的研究与本文结论是一致的[6]。说明胰腺癌细胞存在非常复杂的耐药机制，P-gp的表达是其中之一。
EMMPRIN是免疫球蛋白超家族中的一员, 在多种肿瘤细胞中均发现有EMMPRIN表达的增高[7],在部分肿瘤中还发现随着肿瘤恶性程度的增高EMMPRIN的表达也增高,且与肿瘤的浸润和转移相关[8]。关于EMMPRIN的作用机制目前还不是十分清楚，得到认可的是：肿瘤细胞产生的EMMPRIN可刺激肿瘤周围的纤维母细胞产生多种金属蛋白酶,而且还可能使肿瘤细胞自身合成金属蛋白酶,并以自分泌方式降解周围基质而引起肿瘤浸润[9-10]。因此,EMMPRIN在肿瘤的浸润中起着关键性的作用。关于EMMPRIN在胰腺癌中的表达及意义，国外尚未见报道，国内报道[11]指出胰腺癌EMMPRIN表达阳性率明显高于慢性胰腺炎(P<0.01),高分化腺癌和无转移癌EMMPRIN表达阳性率明显低于低分化腺癌和转移癌(P<0.05或P<0.01)。本文也发现无转移癌EMMPRIN表达阳性率明显低于转移癌（P<0.05），但未发现与胰腺癌的分化有关。
胰腺肿瘤的生长和转移有赖于血管生成，在众多促血管生成的因子中，血管内皮生长因子VEGF是目前已知最重要的因子。1993年,Brown等[12]首次对单个胰腺癌标本进行免疫阳性染色,发现了VEGFA的表达。Itakura等[13]检测了人类胰腺癌细胞系和组织学标本中VEGF的表达,发现VEGFmRNA和蛋白在两者中均有表达,胰腺癌组织中VEGFmRNA含量是正常胰腺组织的5倍以上,用VEGF结合VEGFR阳性的细胞,发现胰腺癌细胞生长明显增多。国内外的大多研究结果显示[14-16]：VEGF在胰腺癌标本中高表达，其表达与胰腺癌临床分期相关，和本文结论一致。
本研究最关心的是以上几个对胰腺癌的进展都起作用的因子之间有何关联, Yang[17]等报道在培养的MDR肿瘤细胞中,P-gp和EMMPRIN的过表达有着明显的关联,我们的实验中也发现在未经过化学治疗的胰腺癌中P-gp的过表达和EMMPRIN的过表达明显呈正相关性,对于其机制,未完全明了。但有些分子实验发现MDR1活性的改变是通过MAPK途径的[18]。而且,MDR1的活性可以被MAPK/Erk抑制物U 0126封闭,而EMMPRIN刺激MMPs产生也是涉及MAPK信号系统,如Lim等[19]报道肺癌细胞中EMMPRIN刺激MMP 1产生就是通过MAPK/p38。Yang[17]等发现U-0126抑制MAPK/Erk的同时也降低MMP 9、MMP 2和MMP 1的活性和表达。推测MDR1的诱导和EMMPRIN调节MMPs可能是利用同一条信息通道的。但是,EMMPRIN的表达上调是否和MDR1的诱导同步,EMMPRIN的表达是如何上调的, EMMPRIN是否能上调MDR1，而反过来MDR1的诱导能否会使EMMPRIN的表达上调等等问题还有待进一步研究。因为如果能肯定这种关系,就能通过干预EMMPRIN而影响P- gp的生成,从而降低肿瘤细胞的耐药性；同时若MDR1的诱导能会使EMMPRIN的表达上调也提醒我们在肿瘤化疗的过程中药物使用的周期、剂量等要规范操作，否则在引起耐药的同时也会加速肿瘤的浸润转移，严重影响患者的预后。
肿瘤的生长、浸润和转移是个主动的过程，在这个过程中包括:粘附、基质的降解、移动和血管生成。EMMPRIN能促进MMPs的生成与肿瘤的浸润密切相关，其在血管生成的环节上是否也有影响呢？本文通过免疫组化的方法发现EEPRIN和VEGF之间存在相关性。 Kanekura[20]也文中指出EMMPRIN刺激肿瘤周围纤维母细胞产生MMP，而MMP在降解基底膜和间质的过程中使得内皮细胞可以移动，同时又释放出血管反馈通路中的一些因子如VEGF刺激新生血管的形成，直接刺激肿瘤的生长。商澎等[21]在体外抗基质降解和体内抗肿瘤转移的基础上,进一步探讨CD147/HAb18G拮抗肽是否对血管生成也具有抑制作用。实验结果表明,他们设计的靶向肿瘤转移相关抗原HAb18G/ CD147/EMMPRIN分子,从上游阻断或减少肿瘤细胞其效应细胞产生MMPS的拮抗肽(APs),也部分具有一定的抗血管生成的作用。但是这种抗血管生成作用是直接作用于血管内皮细胞,还是通过对MMPS的影响而间接发挥作用,其作用机制还有待于进一步的研究。而最近Tang等[22]在一篇文中在指出，在人乳腺癌中EMMPRIN的表达可以在RNA和蛋白水平上影响VEGF的表达。在体外培养的肿瘤细胞和模拟的肿瘤基质细胞的共同作用下，VEGF的表达被EMMPRIN 和MMP所诱导，且随着EMMPRIN的过表达而被显著增强，相反的也会随着EMMPRIN表达的减少而下降。而在体内也得出相同的结果。并且实验证明EMMPRIN可分别诱导VEGF和MMP的表达，因而得出结论：EMMPRIN可以通过促进VEGF和MMP的表达而影响肿瘤的浸润、转移。目前抗血管生成药和抗金属基质蛋白酶的试验均已进入III期临床，且取得了一定的成效，倘若我们将EMMPRIN作为一个新的靶点在上游阻断，则可能同时阻断了VEGF和MMP的生成并减少肿瘤的耐药，从而有效的遏制肿瘤的进展。从理论上看，EMMPRIN作为一个新的靶点有良好的应用前景。
综上述，胰腺肿瘤细胞在耐药、浸润和转移之间有一定的相关性，EMMPRIN作为一个新的靶点可能可以同时阻断了VEGF和MMP的生成并减少肿瘤的耐药。另外，在胰腺癌的化疗中要规范治疗，在减少耐药的同时可能也减少了肿瘤浸润转移的危险性。
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